1.血液样本采集

静脉采血6mL-8mL，血液样本使用EDTA抗凝真空采血管（Anticoagulation tube）收集。

具体采样方式应按照《中华人民共和国卫生行业标准》WS/T611-2020,“静脉血液标本采集指南”执行。该规章按照“GB/T 1.1—2009 ”给出的规则起草。

2.血液样本类型

血液样本：EDTA抗凝全血。

※血液样本溶血会降低检测效率。

3.PBMC分离步骤

                              著有※步骤比较关键，需严格按照操作指导进行

1）原始样品预处理：血液样本上下翻转5-8次混匀，使用移液器从血液采集管吸取4mL±100μL血液样本至15mL离心管，做好标记。（注意：血液样本较为黏稠，操作时需避免吸入移液器造成交叉污染，吸取血液样本时需缓慢进行，且为了保证转移体积的相对精确，需要预先要先吸取并推出血液样本使其挂在移液器枪头内壁，完成吸头的血液样本预挂壁，再进行转移工作。）

2）样本密度梯度分离液分装：使用移液器吸取4mL±100μL样本密度梯度分离液至15mL离心管，做好标记，待其升至室温（推荐温度在14-27℃）备用。

3）血液样本稀释：在装有4mL血液的15mL离心管内加入4mL±100μL的样本稀释液（PBS），上下翻转5至8次，缓慢混匀。

4）※密度梯度分离前处理：使用移液器转移稀释后的血液样本至装有4mL±100μL样本密度梯度分离液的15mL离心管内。注意：转移过程需轻缓，尽可能保证血液样本与样本密度梯度分离液呈分层状态。（推荐的转移方式：转移稀释血液样本时需要借助移液器，转移最开始的1mL血液时需要将装有密度梯度分离液的15mL离心管倾斜45°±10°，移液器吸头深伸入内，抵住下侧内壁，吸头距离密度梯度分离液约1cm，此时缓慢推出血液样本，按照上述方式转移第2mL血液样本，完成2mL的血液样本转移后可将装有密度梯度分离液的15mL离心管竖直放在管架，此时正常转移剩余6mL血液样本可以避免血液与密度梯度分离液混合，共计加入8mL稀释血液样本，此时管内具有12mL液体。）

5）样本离心，离心条件：20℃±5℃，推荐温度恒定为25℃；离心力700g；水平转子；升降速度为1；离心时间为20min。（湘仪其它离心机需要进行预实验自测）

离心结束后，样本应分为四层，从上到下依次是血浆层、乳白色 PBMC 层（约1-2mm）、分离液层、红细胞层（如图1）。注意：若离心结束后未能肉眼观察到明显的4层，则表明样本制备失败。

图1 密度梯度离心后的分层示意图

4.PBMC回收

1）使用移液器移除5.5 mL血浆层，至废液回收瓶内，前4.5mL可以正常使用移液器操作，剩余1.5mL血浆层的吸取需使移液器吸头逐渐随着页面向下移动，且吸取过程尽量轻柔缓慢避免过快的吸力破坏PBMC层。

2）※使用移液器转移2 mL的PBMC层，吸取需使移液器吸头逐渐随着页面向下移动，且吸取过程尽量轻柔缓慢，该过程可以适量吸入血浆层及分离液层，但要保证PBMC完全转移。注意：过度苛刻的避免血浆层尤其是分离液层的吸入会影响PBMC中CTC细胞的数量。（推荐的操作：倾斜离心管呈30°±10°，1mL移液器吸头伸入残余血浆层，吸头距PBMC上层约1-2mm时开始吸液，吸液过程吸头随PBMC层下移，反复操作2次完成2mL液体的转移。）

3）离心管内剩余液体转移至废液回收瓶内，废液按照各执行部门相关规定细则处理。

4）在装有PBMC悬液的15mL离心管中加入5mL的PBS溶液重悬PBMC细胞，静置1min，离心处理，离心条件：20℃±5℃，推荐温度恒定为25℃；离心力500g；水平转子；升降速度为9；离心时间为5min。

5）离心完成后将离心管转移至生物安全柜，吸除上层清液，此步骤避免吸走沉淀。

6）加入250-300μL的PBS溶液重悬PBMC细胞，使其最终定容在300μL±20μL，完成PBMC悬液样本制备。注意：完成制备的PBMC样本应在尽量在15min内完成上样操作，上样时应使用移液器再次吸打混匀，以保证重悬的PBMC细胞在上机前无显著肉眼可见絮状团块，或残留沉淀。